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病原体

乳头瘤病毒科病毒所致疾病

来源:未知 发布时间:2013-08-05 18:54 点击次数:

 第一节 恒河猴乳头瘤病毒I型感染

一、发生与分布
恒河猴乳头瘤病毒I型(Rhesus Monkey Papillomavirus 1,RhPV-1)是1988年由Kloster等人首先从一只患阴茎癌的雄性恒河猴(Maccaca mulatta)身上分离到的,1990年,Ostrow等人也用分子生物学和病理学方法从其它患有类似疾病的恒河猴身上检测到该病毒。
RhPV-1感染恒河猴后可致感染黏膜上产生乳头状瘤,即俗称的“疣”,这一比例约在35%左右;并有一小部分发展为癌症,该数据尚无定论,有报道用30只母猴和一只诊断为阴茎癌的且有RhPV-1感染的动物放在同一群体中,最终有两只母猴分别患上鳞状上皮细胞癌和子宫内膜腺癌。也有一些动物感染RhPV-1后并无临床表现,在该文献中29%的动物被检出RhPV-1 DNA,但没有任何临床症状,而且组织病理学等检测也为阴性。这在人群中也有类似的情况,即能检出人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus ,HPV)DNA,但是无临床症状,出现所谓的“隐性感染”这一比例约为23%。出现“隐性感染”的机制尚不明确,因为疾病的发展和遗传因素、免疫功能、其它病毒的感染、环境因素等诸多因素都有密切联系。
所见报道中,所用的恒河猴多来自印度、印度尼西亚,也有一小部分来自中国及远东地区,结果显示各地的恒河猴均可感染RhPV-1。未见国内关于RhPV-1感染情况的报道。
二、病原
(一)分类地位
从上世纪60年代到2000年,乳头瘤病毒和多瘤病毒一直被划分在乳多空病毒科(Papovaviridae)中,2000年,国际病毒分类委员会(International Comittee on Taxonomy of Viruses,ICTV)正式批准取消乳多空病毒科,设立了乳头瘤病毒科(Papillomaviridae)和多瘤病毒科(polymaviridae),乳头瘤病毒科中有30个属,包括来自多种哺乳动物和鸟类的乳头瘤病毒。RhPV-1即属于乳头瘤病毒科(Papillomaviridae),α-乳头瘤病毒属(Alphapapillomavirus),恒河猴乳头瘤病毒(Rhesus Monkey Papillomavirus)。恒河猴乳头瘤病毒是第一个也是仅有的一个被ICTV定义为“种(Species)”的灵长类动物乳头瘤病毒,根据其L1基因序列一共划分出了13种RhPV,除了RhPV-1,还有RhPV-a,RhPV-b, RhPV-c, RhPV-d, RhPV-e, RhPV-f, RhPV-g, RhPV-h, RhPV-i, RhPV-j, RhPV-k, RhPV-m。相信随着研究的深入,将会有更多的RhPV被发现。
乳头瘤病毒的α-、β-、γ-三个属中包括了几乎所有的HPV,其中易致恶性肿瘤的高危亚型HPV-16,HPV-18都属于α乳头瘤病毒属,而RhPV也是属于α乳头瘤病毒属的。同一个属内的乳头瘤病毒更倾向于拥有相似的生物学特性,α乳头瘤病毒最大的共同特性是该类病毒都是“生殖道-黏膜”乳头瘤病毒,因为它们通常只感染生殖道和其它黏膜。
(二)形态学基本特征与培养特性
恒河猴乳头瘤病毒是双链DNA无包膜病毒,从形态学上看,该病毒很小,直径只有55nm,呈正二十面体状,病毒的衣壳由72个五聚体衣壳体组成,每个衣壳体由L1和L2两种蛋白组成,其中L1是主要结构蛋白,占病毒总重量的80%;L2是次要结构蛋白。衣壳体由蜂窝状组蛋白缔结联合成衣壳,病毒的DNA就包裹在其中。
RhPV-1无法直接进行体外培养,但将RhPV-1 的DNA 克隆到pUC19质粒的BamHI酶切位点,制成质粒载体,无论是否配合地塞米松,RhPV-1 DNA都可以转化大鼠婴肾细胞(Baby Rat Kidney cell,BRK)。
(三)分子生物学
RhPV-1和人乳头瘤病毒基因组很相似,是双链闭环小DNA病毒,包含约八千个碱基对,包含早期基因区(E),晚期基因区(L)和长控制区(LCR)三个部分,早期基因区可以编码E1,E2,E3,E4,E5,E6,E7等早期蛋白,其功能与病毒的复制、转录、翻译调控和细胞转化有关,其中E6和E7是主要的致癌基因;晚期基因区可以编码主要衣壳蛋白(L1)和次要衣壳蛋白(L2);长控制区含有基因组DNA复制起点和基因表达所必须的控制元件,调控病毒基因的转录复制。

  1. 流行病学

(一)传染来源
RhPV-1的患病动物和携带病毒的动物是最主要的传染来源。该病毒广泛存在于感染动物的生殖道黏膜、病灶部位,也可转移到神经节。
(二)传播途径
RhPV-1主要是通过性接触传播,也可以通过接触感染部位或污染的器具传播,母体感染后也可以通过产道传染给下一代。感染通常是局部的,不通过血流扩散。
1990年,Ostrow等人将一只患阴茎癌且伴随RhPV-1感染并已转移到淋巴结的公猴和30只母猴及另一只公猴置于一个群体中,最终,和这只公猴有过性接触的母猴中的71%都出现了RhPV-1感染的临床症状、组织病理学检测阳性和/或分子生物学检测阳性结果。其中一只动物诊断为子宫颈鳞状细胞癌,另一只诊断为宫颈内膜腺癌,另外还有11只(35%)有低级别的疣,伴随不同程度病变和/或醋酸白试验阳性。该实验组中的另一只公猴也被确定为RhPV-1阳性。而对照组中的11只动物(包括有交配行为的4只和无交配史的7只)均未发现感染RhPV-1的病理组织学、分子生物学证据,也未有任何临床症状。这一研究充分证明了性传播是RhPV-1的主要传播途径。
三)易感动物
1.自然宿主
多种哺乳动物和鸟类都会感染乳头瘤病毒,但不同动物的乳头瘤病毒有较强的种属特异性,目前尚未发现哪种乳头瘤病毒同时以人和其它动物作为宿主,尚无任何一种HPV感染动物或动物乳头瘤病毒感染人的报道。RhPV-1也不例外,仅以恒河猴为宿主。
2.实验动物
未见用RhPV-1感染实验动物的报道。
3.易感人群
由于RhPV-1具有较强的种属特异性,未见感染人或其他动物的报道。
(四)流行特征
RhPV-1在来自多个不同实验室和/或科研机构的恒河猴种群中均有检出。1995年,在Ostrow等人的另一项研究中,对数个恒河猴种群做了回顾性研究,发现用血清学方法检测不同种群的动物RhPV-1阳性率在38%-62%,用分子生物学方法检测这些动物的组织样本中的RhPV-1 DNA ,阳性率在10%-46%之间,具体如下:
第一组58只动物,从野外捕获后一直单笼饲养的动物血清学检测结果显示38%的动物是RhPV-1阳性,这是所检测的4个种群中阳性率最低的一组;第二组50只动物生活在可以自由交配的种群中,血清学检测结果显示44%的动物是阳性;第三组48只动物,也生活在可以自由交配的种群中,血清学检测显示有52%的动物是阳性,其中44只用分子生物学方法检测后只有4只是PCR和血清学同时阳性,其余均为PCR阴性;第四组13只动物,也生活在允许交配的社会群体中,有62%是血清学检测阳性的,做分子生物学检测发现46%为两种方法都为阳性,另有2个仅检测到RhPV-1 DNA,还有3只血清学反应阳性,PCR阴性,不论是血清学方法还是PCR方法,这一种群的RhPV-1阳性率都是所检测的四组中阳性率最高的。
综合以上数据以及Ostrow1990年的研究数据可以得出结论,恒河猴的性生活史和RhPV-1感染率密切相关,这是RhPV-1在猴群中感染情况最显著的特点。单一RhPV-1感染和多重RhPV感染均有报道,而RhPV的持续性感染是生殖道疾病的关键病因,这和HPV在人群中的感染情况是相似的。

  1. 临床症状

RhPV-1感染恒河猴后如不能被及时清除或伴随其他病毒发生持续感染会出现不同程度的病变,产生乳头状瘤,这是最常见的症状,此外还会出现不典型增生,和/或醋酸白试验阳性,病情得不到控制还会继续演变成更高级别的上皮内瘤变,甚至发展成为宫颈癌、阴茎癌等恶性肿瘤。但是也有约29%的动物感染RhPV-1后不会出现任何症状。

  1. 病理变化

(一)大体解剖观察
RhPV-1感染猕猴后有可能在临床上并无任何病理变化,但如果发生持续感染也有会由良性生殖道疣慢慢发展成为上皮内瘤变甚至发展成阴茎癌、宫颈癌等恶性肿瘤。
(二)病理组织学观察
感染RhPV-1并发生病变后,病理组织学检测时通常表现为基底细胞和副基粒细胞数量增加、出现凹空细胞、细胞核非典型性扩大,细胞分化不良、排列紊乱、有丝分裂增加、不典型增生;宫颈活检的组织切片中还可能会发现核异型性、灶性浸润、分化良好的鳞状细胞癌等。

  1.  诊断

恒河猴乳头瘤病毒感染的诊断主要有血清学诊断、分子生物学诊断和病理组织学诊断方法。
(一)血清学试验
20世纪50年代,随着免疫学的发展,在血清中也可检测到一些抗体,作为宫颈癌诊断与治疗的标志物。可应用重组技术表达抗原检测人血清中相应的HPV抗体,或用抗原免疫动物制备免疫血清或单克隆抗体检测组织或局部黏液中HPV抗原。RhPV-1的血清学检测也是建立在这个基础上的。可以利用基因重组技术表达需要的抗原蛋白,用于检测相应的RhPV-1抗体,常用的基因有E2,E4,E7,L1,L2。血清学方法中的DIA,ELISA都比较简单,而且成本低,实验周期短,适合于大规模的筛查,阳性和可疑的样本常用Western Blotting 确证,但血清学用于RhPV-1的检测也有其局限性,表现在以下几个方面:
1. 多数感染过乳头瘤病毒的动物均有可能在血清中出现抗体,抗体在体内持续时间较长,有的达数年,抗体阳性并不表示有RhPV-1感染,这一原因造成了大量的假阳性,体现为血清学检测阳性,PCR方法却无法检测到RhPV-1 DNA;
2. 由于机体对病毒感染产生免疫应答有一定的迟滞性,所以血清学检测对无免疫应答者和潜伏期感染者会产生漏检;
3. RhPV-1感染后并不一定能产生血清学可检测到的水平的免疫应答,这可能会造成漏检;
4. 最后,目前的技术还不能区别那些会和RhPV的抗原发生交叉反应的非乳头瘤病毒抗体,所以会导致出现假阳性结果。
(二)分子生物学诊断
目前,分子生物学方法在人乳头瘤病毒检测中已被广泛应用,主要包括聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)和核酸分子杂交技术。
PCR方法不仅是目前最灵敏的检测方法,也是检测病毒感染最直接的方法,且PCR相对简单、省时、标本来源不受限制,故而是目前RhPV-1检测中最常用的方法。针对RhPV-1的L1,L2,E6,E7等多个基因都有引物被设计使用。PCR方法也有其固有的缺陷,比如其高灵敏度带来的假阳性,另外,样本采集、处理不当极易造成病毒DNA丢失,这在HPV的检测中已被证实,发生这种情况只有通过重新取样才能得到纠正。
另外,核酸杂交检测方法也是常用的检测手段之一,主要包括原位杂交法(In situ hybridization,ISH)、核酸印迹法(Southern blot)等。ISH首先将RhPV-1探针和待检样本中的RhPV-1双链DNA变性为单链,然后使探针与样本中的RhPV-1杂交,达到检测目的。其优点是利于病理学分析,但杂交链的稳定性不高,在杂交过程中可能有部分探针单链复性,使杂交率降低,影响检出率。Southern blot适用于RhPV分型等早期研究,但必需为新鲜组织标本且操作复杂。
(三)组织病理学诊断
组织病理学诊断在HPV的临床诊断中是最常用的检测方法之一,是确定诊断和治疗的金标准。在RhPV-1的诊断上,组织病理学诊断也同样适用。
RhPV-1病毒的检测常常是几种方法结合使用,因为单独使用任何一种方法都容易造成误判和/或漏检。

  1. 防制措施

由于乳头瘤病毒较强的种属特异性,种间传播难以实现,因而RhPV-1本身并不会对人类健康造成威胁,反而是感染了RhPV-1的恒河猴可以作为良好的模型用于HPV所致疾病的相关研究。
在恒河猴野生种群和繁殖种群中,对RhPV-1并没有很好的防治措施,但是对于实验用猴,单笼饲养或将不同性别的动物隔离饲养不失为切断病毒传播途径、降低感染率的好办法。

  1. 公共卫生影响

宫颈癌是女性常见恶性肿瘤之一,在全球范围内,每年约有40多万女性死于宫颈癌,宫颈癌虽然可怕,但也是可防可治的,因为流行病学和基础研究已经证实HPV的持续感染是CIN和宫颈癌的主要病因,99.8%的宫颈癌都合并HPV感染。美国FDA 2006年批准了HPV疫苗上市,但是在远期效果等方面也还存在许多亟待研究的课题。而且,除了宫颈癌,HPV和生殖器疣等多种类型的病变都有关系。
目前,HPV所引起的这一系列疾病需要有一个有意义的模型用于预防、治疗研究。RhPV-1和人的致癌高危型HPV-16、HPV-18不仅都属于α-PV属,而且它们的的性传播特性、隐性感染、由良性肿瘤到恶性肿瘤的演变过程等各个方面都是一样的。因此,感染RhPV-1的动物将会是一种用于乳头瘤病毒高危亚型致癌研究的良好模型。在HPV这个庞大的病毒军团中,亲缘关系较近的病毒常常表现为相似的病理病变,例如HPV-16就和同样是在子宫癌样本中发现的HPV-31,HPV-33, HPV-35亲缘关系较近,而且,发生多重感染的几率达到23%左右。与之相对应的,RhPV-1是在阴茎癌组织中分离得到的,同时又和其它四种RhPV(RhPV-a,RhPV-b,RhPV-d和RhPV-e)亲缘关系最近,那么如果我们将这五种RhPV作为一个“组合”,建立生殖道恶性肿瘤病变模型并用于HPV感染的疫苗研究、免疫学研究和药物研究,可能意义更大。但目前的问题是,自发感染RhPV-1并发展成为生殖道恶性肿瘤的动物数量十分稀少,不能作为有效的模型投入使用。

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